近代ヨーロッパで最も歴史のある美術館とし知られるウフィッツィ美術館だが、もともとはジョルジョ・ヴァザーリの設計でメディチ家コジモ1世のために１５６０年から１５８０年にかけて建設されたもので、最初の目的は１３の行政の機関、つまり英語のオフィス（イタリア語でufficioウッフィーチョ、ここから名前がとられた）を置くためのものとしてであった。フランチェスコ１世の要望により（おそらくコジモ１世がすでに考えていたと思われるが）１５８４年ベルナルド・ボンタレンティによりメディチ家所有の貴重な彫刻や絵画を収める部屋、トリブーナを作った。これが美術館の原点である。こうしてフランチェスコ１世と彼の弟で継承者のフェルニナンド１世らによるもののコレクションが始まった。ギャラリーとしては１５９１年ごろから希望により見学ができた。ボンタレンティ以外にアルフォンソ・パリージもヴァザーリの死後、建設にたずさわった。またその他１５８６年にはフランチェスコ１世のために劇場も作られ、後にいろいろな用途に使用された。
この建物の建設計画は16世紀のフィレンツェにおいて都市計画、記念建造物の観点から見て非常に大胆なものであった。それは今現在のヴェッキオ宮殿と現在の美術館の間にあった１０６８年に奉納されたロマネスク様式のサン・ピエル・スケラッジョ教会をも壊しての計画だった。この教会の存在は美術館の内、外側の壁に埋め込まれるように残る柱から今でも見ることができる。
建物の様式は安定感があり頑丈なドリス式で、素材は当時、法律で統治者のみに使用が許されていたメンソラ渓谷のグレーの石材が使われている。またアルノ川沿いという立地条件からも高度な建設技術が要求された。
現在絵画が展示されている３階部分はもともとはオープン形式の回廊であったが、絵画、彫刻等のコレクションにより現在のような形になっていった。